【包裝規格】 48/96 測試 

【預期用途】 檢測小鼠生物標本中 TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 的表達水平。

【檢驗原理】 

     本試劑盒采用 CBA 多因子流式檢測技術，微球 熒 光 編 碼 不 同 ， 不 同 微 球 群 上 包 被 mouse TNF- α /IFN- γ /IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 特異性抗體，與待測樣本孵育，可與樣本中 mouse TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 特異性結合，之后加入生物素標記的檢測抗體，形成抗體包被微球-細胞因子-檢測抗體的免疫復合物；最后加入藻紅蛋白 標記的鏈霉親和素，與生物素結合，通過流式細胞儀檢測，獲得待測物的熒光強度，熒光強度與樣本中 mouse TNF-α、 IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12、MCP-1 的含量成正比，最后結合這六種細胞因子標準品的標準曲線，從而實現對同一份樣 本中 mouse TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 的定量檢測。從而輔助判斷機體的免疫功能狀態。

【試劑盒組分】

注：試劑盒中不包括，但試驗需要的材料：流式管，15 mL 離心管，1.5 mL EP 管，錫箔紙，磁力板。

【儲存條件及有效期】

     2～8℃，避光保存，有效期 12 個月。開瓶后避光2～8℃保存，可保存不超過 30 天。

【適用機型】

     本品適用于 BD 公司的 BD FACSCanto II、Beckman Navios 6/2 和艾森公司的 ACEA NovoCyte 等有 PE、APC 通道的 流式細胞儀。 

【樣本要求】

     血清：建議 4-6 小時內檢測，如無法及時檢測請-20℃凍存，忌反復凍融。

【檢驗方法】

     1 洗液（1×）的準備 顛倒混合標有 20×洗液的瓶子。在 475 mL 蒸餾水中加入 20×洗液 25 mL，并輕輕混合以免起泡沫。儲存于 2～8℃待用。

     2 標準品制備（準備 8 個 1.5 mL EP 管分別編號 1.2.3.4.5.6.7.8） 

          2.1 取出標準品凍干粉，每個因子用 20 μL 標準品/樣品稀釋液溶解，充分混勻，室溫放置 10 分鐘，將溶解后的六個因 子轉移至 1 號管，并補 80ul 標準品/樣品稀釋液，作為標準品最高濃度 5000 pg/mL。

          2.2 其他 7 個（2～8 號）EP 管中分別加入 150 μL 標準品/樣品稀釋液，準備梯度稀釋標準品。 

          2.3 在 1 號管中轉移 50 μL 標準品到 2 號管充分混勻，再在 2 號管轉移 50 μL 到 3 號管充分混勻。以同樣方式依次連續 稀釋到 7 號管。

     3 捕獲微球混合液處理 

          確定實驗孔數（包括標準品和樣本），計算所需捕獲微球混合液的用量。例如：待測樣本88個，標準品8個，共計96孔。 每個孔需要捕獲微球混合液50 μL。我們可以按100孔的量進行微球混合，需取5000 μL捕獲微球混合液。（注意：需將 捕獲微球渦旋20 s，充分混勻后再?。?nbsp;

     4 樣本處理 

          建議對于血清或血漿樣本需使用標準品/樣品稀釋液進行2倍稀釋。

                                                                                                                            表1

     5 操作步驟

          *實驗前將所有試劑取出平衡至室溫；5 操作步驟

          *實驗過程中，包括清洗步驟，將板子始終水平放置，以免珠子丟失； 

          *孵育過程中，板子應注意避光。

          5.1 從梯度稀釋好的標準品 1-8 號管中分別取出 50 μL 移入對應的 96 孔板孔中。 

          5.2 其余樣本孔每孔加入稀釋好的血清或血漿樣本 50 μL。

          5.3 渦旋微球 30 s，每孔加入 50 μL 微球，現每孔體積應為 100 μL/孔。（加微球過程中應隨時渦旋微球管，避免微球 沉降，建議每加 8 個孔，渦旋混勻一次微球）。 

          5.4 將 96 孔板放到搖床上 450 rpm/min 搖 2min 后，放入 37℃溫箱，避光孵育 30min。

          5.5 將 96 孔板卡在磁力板上 5 min，去除上清。

          5.6 將 96 孔板從磁力板上取下，每孔加入 200 μL 洗液。

          5.7 重復步驟 5.5。 

          5.8 將 96 孔板從磁力板上取下，每孔加入 100 μL 檢測抗體。 

          5.9 將 96 孔板放到搖床上 450 rpm/min 搖 2min 后，放入 37℃溫箱，避光孵育 30min。 

          5.10 重復步驟 5.5-5.7。 

          5.11 將 96 孔板從磁力板上取下，每孔加入 100 μL 藻紅蛋白標記的鏈霉親和素。 

          5.12 將 96 孔板放到搖床上 450 rpm/min 搖 2min 后，放入 37℃溫箱，避光孵育 15min。 

          5.13 重復步驟 5.5-5.7。 

          5.14 每孔加入 200 μL 洗液重懸樣本，上流式細胞儀檢測。 

     6 流式細胞儀檢測

          6.1 微球群分布：

注：微球內部用不同強度的熒光染料染色。

           6.2 模板建立： 

                建立X軸為FSC、Y軸為SSC的線性散點圖模板，設定混合微球位置，如下圖 1； 

                建議兩個PE（X軸）和APC的對數散點圖模板，分別顯示R1門或R2門內微球，使得所有的微球群能夠清楚和明顯的分布于 散點圖上，顯示各因子PE熒光強度。如圖2，圖3。

       調節PE PMT電壓，使所有微球群右側不壓線，左側位于PE軸檢測范圍內（圖2,3）。 

          6.3 樣品的檢測結果分析 

                各標準品及樣本依次上機檢測，對于每種微球群，應最少獲取100個微球。利用標準品梯度作標曲，計算樣本檢測結果。

【檢測結果的解釋】

      1. 待檢測樣本細胞因子的測定在表 3 檢測范圍內，測定結果有效，可直接報告測定結果；若檢測結果超出檢測范圍，應用 標準品/樣品/微球稀釋液將樣本稀釋適當的倍數重新檢測；若待測樣本的檢測結果低于檢測下限或未檢測到，則直接報告為≤最 低檢測值。

                                                                                                                      表3

     2. 建議：負責數據揭示和出具報告的實驗人員需經過正規的技術培訓。

【檢驗方法的局限性】 

     1. 不合理的樣本采集、轉運、儲存、處理以及儀器的設置不當均有可能導致錯誤的檢測結果。

【產品性能指標】

1. 外觀和性狀 

     試劑盒各組份應齊全、完整，液體無滲漏；外包裝應完整、無破損，標簽應清晰、易識別。 

2. 裝量 

     應符合要求，不低于標示值。

3. 準確度 

     使用本試劑盒檢測已知濃度的樣本，其檢測結果相對偏差在±15%以內。

4. 重復性 

     本試劑盒檢測 TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1 變異系數（CV）應≤15%。

【注意事項】

     1. 實驗樣本、質控/標準品、實驗廢棄物等材料應當作為潛在傳染物進行處理，并且采用符合法規的預防措施對其處理。 

     2. 流式細胞儀未經正確校準、熒光滲漏未進行合理補償以及檢測區域（設門）未精確定位，則可能產生錯誤的檢測結果。 請參考該儀器操作規程進行校準，確保儀器在使用前處于最佳檢測狀態。

     3. 本品含熒光素，切勿直接接觸皮膚或沾染食物，操作時務必戴手套操作。

     4. 標準品在配成溶液后，請在10小時內使用。 

     5. 在使用之前，捕獲微球混合液必須充分的振動混合。

     6. 為確保熒光檢測質量，凡涉及檢測抗體的相關步驟都需避光操作。 

     7. 不同批號的試劑請勿混用，并請在有效期范圍內使用。